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4.4 Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH)


4.4.1 Vorbehandlung mit Signalamplifikation

Neben der Verbesserung der Zugänglichkeit für die FISH führt die Inkubation mit Pepsin/HCl auch zur Verringerung von Resten des Nukleoplasmas im Präparat (Nenno et al. 1994). Dies spielt für die Detektion von Sequenzen, die nur in geringer Kopienzahl vorliegen oder die nur schwache Signale zeigen, eine größere Rolle, als für die hoch- und mittelrepetitive Sequenzen mit starken Signalen. Starke Signale sind meist bereits nach einer Lage Fluorochrom-gekoppelter Antikörper erkennbar. Schwache Signale müssen hingegen in der Regel erst durch Signalamplifikation verstärkt werden.

Eine Signalamplifikation war neben dem Nachweis der low-copy Gene von Phaseolin vor allem für die Detektion der 5'-endmarkierten Oligonukleotid-Sonden für Mini- und Mikrosatelliten notwendig. Letztere kommen zwar in vielen Tausenden von Kopien im Genom vor, aber die Signalstärke der aus 15 bzw. 16 Nukleotiden bestehenden Oligonukleotid-Sonden ist gering und kommt ohne Signalamplifikation nicht aus. Um die Hintergrundsignale möglichst gering zu halten, die bei der Signalamplifikation unweigerlich auftreten, wurde die HCl-Konzentration von bisher 0,02 M auf 0,05 M erhöht.

4.4.2 Lokalisation der 18-25S und 5S ribosomalen RNA Gene

Die Loci der Gene für die ribosomale 18S-25S RNAs sowie die 5S RNA wurden auf den Polytänchromosomen von Phaseolus bereits mittels radioaktiver ISH und FISH lokalisiert (Avanzi et al. 1972; Durante et al. 1977; Schumann et al. 1990; Tagliasacchi et al. 1993; Nenno et al. 1994). Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Loci der beiden rDNAs neu bestimmt, um sie anhand des hier beschriebenen Idiogramms auf der cytogenetischen Karte zu kartieren (vgl. Abbildung 19). Die Signale der 18S-25S rDNA wurden auf den drei NO-Chromosomen A, I und K jeweils an terminaler Position lokalisiert. Entsprechend dem Kondensationsgrad des Chromatins der NOR (vgl. Schema in Abbildung 20) waren die Signale in dichtem Chromatin stark bzw. in aufgelockertem Chromatin schwächer und ließen die Signalpunkte fast einzeln wie "Perlen an einer Kette aufgereiht" erkennen (vgl. Abbildung 13a).

Die 5S rDNA liegt nach den hier vorgelegten Ergebnissen mit je einem Locus im Bereich des cHC auf den NO-Chromosomen I und K. Durante et al. (1977) beschrieben die 5S rDNA-Loci auf Chromosom I und VI. Auf Chromosomen I (vermutlich K) fanden sie die Signale im proximalen Heterochromatin (=cHC). Auf Chromosom VI jedoch, beobachteten sie zwei Loci. In 43% der Fälle lagen die Signale im proximalen Heterochromatin (=cHC), in 53% der Fälle auf einer großen interkalaren Heterochromatinbande des langen Arms und in 3% der Fälle zeigten sich Signale an beiden zuvor genannten Loci gleichzeitig. Die Autoren wiesen allerdings auch darauf hin, daß sie das Chromosom VI nicht in allen Kernen identifizieren konnten. Es kann daher nicht ausgeschlossen werden, daß Verwechslungen mit anderen Chromosomen für das Auftreten der Signale an unterschiedlichen Orten verantwortlich sind. Sie hybridisierten auch mit 18S, 5,8S und 25S ribosomaler RNA. Es konnte aber nur ein Chromosomenpaar beobachtet werden, das sowohl einen 18S-25S als auch einen 5S rDNA-Locus aufwies. Wie die hier vorgestellten Ergebnisse der Doppelhybridisierung mit beiden rDNA-Sonden zeigen konnte, tragen zwei Chromosomen jeweils einen 18S-25S und 5S rDNA-Locus (vgl. Abbildung 13).

4.4.3 Verteilung von Mikrosatelliten

Die Verteilung von Mikrosatelliten-Motiven auf Chromosomen von Phaseolus wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals untersucht (vgl. Abschnitt 3.5.2) und ihre Loci in die cytogenetische Karte (vgl. Abbildung 19) eingetragen.

Die Loci der 12 untersuchten Mikrosatelliten wiesen z. T. große Unterschiede in ihrer Signalstärke auf. Einige Signale bestanden aus Ansammlungen von nur wenigen Signalpunkten, während andere größere Bereiche im cHC ausfüllten. Je schwächer die Signale waren, um so unregelmäßiger war im allgemeinen auch ihr Auftreten. Es wurden daher nur regelmäßig auftretende Loci berücksichtigt. Dies bedeutet, daß es außer den hier beschriebenen Loci noch weitere, schwächere gibt, die aber aufgrund ihres variablen Erscheinens hier Außeracht gelassen wurden.

Für die Frage nach der Verteilung der Mikrosatelliten im Eu- und Heterochromatin wurden insgesamt 57 Loci der 12 Motive ausgewertet (vgl. Tabelle 9). Signale in den NOR wurden hierbei nicht berücksichtigt. Die Mehrzahl der Mikrosatelliten-Loci (32) fanden sich im cHC, aber auch im Euchromatin wurden 25 Loci beobachtet. Ferner sind die Motive nicht gleichmäßig über die Chromosomen verteilt. Die meisten Motive kommen auf mehreren Chromosomen vor, während einige auf nur zwei oder drei Chromosomen zu finden sind (z. B. auf zwei: (GATA)4, (GACA)4; auf drei: (AAT)5, (CAC)5). Das Motiv (AATG)4 ist gar im cHC aller elf Polytänchromosomen verbreitet. Ebenso variiert die Anzahl der Loci eines Motivs auf verschiedenen Chromosomen. Beispielsweise kommt (CAC)5 auf drei Chromosomen nur jeweils an einer Stelle vor, wohingegen (AG)8 auf den insgesamt vier Chromosomen A, B, C und K jeweils 2, 3, 3 und 1 mal auftritt. Letztere Beobachtung scheint nicht ungewöhnlich, da (Wang et al. 1994) durch Datenbanksuche in bekannten DNA-Sequenzen von Pflanzen das (AG)n-Element als das dritthäufigste Mikrosatelliten-Motiv nach (AT)n und (A)n beschrieben hat.

Die Auswertung der drei Motive (C)16, (GC)8 und (GCC)5 nehmen eine Sonderstellung ein. Bei der Detektion der beiden ersten, (C)16 und (GC)8 ergab die Hybridisierung unter den errechneten Hybridisierungs- und Waschtemperaturen (Th=59°C) keine Signale. Erst unter weniger stringenten Bedingungen (Th=40°C und 50°C) wurden Hybridisierungssignale sichtbar. Die Loci der Motive unter den beiden niedrig stringenten Temperaturen unterschieden sich nicht, außer daß die Signalintensität bei der höheren Temperatur von 50°C etwas schwächer war. Das 3'-getailte (C)16-Oligonukleotid wurde ebenfalls unter niedrig stringenten Bedinungen hybridisiert und gewaschen. Die Ergebnisse der Signale von GC-reichen Sequenzen sind daher nur eingeschränkt mit den Ergebnissen der anderen neun Mikrosatelliten-Motive, die alle unter hoher Stringenz (Th=Tm-5°C), hybridisiert und gewaschen worden waren, vergleichbar. Dennoch erlauben sie einen ersten Hinweis, daß auch die GC-reichen Sequenzen in allen Abschnitten der Chromosomen vorkommen: direkt im cHC (z. B. (GCC)5: Chromosom B, C und K), im Randbereich des cHC (z. B. (C)16: Chromosom H und J), am Übergang zwischen cHC und Euchromatin (z. B. (C)16: Chromosom B und I) sowie im Euchromatin (z. B. (C)16: Chromosom K; GCC5: Chromosom B).

Die Verteilung der Motive innerhalb des cHC wurde genauer analysiert (vgl. Abschnitt 3.5.5). Dabei wurde nach ihrem Vorkommen in den starken DAPI-Banden oder in den übrigen cHC-Bereichen unterschieden. Es ließ sich beobachten, daß im Bereich der starken DAPI-Banden mehr Signale von AT-reichen Mikrosatelliten-Motive und gleichzeitig weniger GC-reiche zu finden waren, als in den übrigen cHC-Bereichen (vgl. Tabelle 11). Dieser Befund stimmt gut mit der erhöhten DAPI-Fluoreszenz überein. Es erklärt auch, daß die Bereiche der starken DAPI-Banden nach DAPI/PI-Färbung aufgrund ihres höheren Anteils an AT-reichen Sequenzen weiß erscheinen, während die benachbarten cHC-Abschnitte wegen ihres erhöhten Anteils an GC-reichen Sequenzen mehr Rot von PI aufweisen, so daß diese Regionen rosafarben erscheinen.

Auffällig ist die Anhäufung der Loci von neun verschiedenen Motiven im cHC von Chromosom B, im Bereich der starken DAPI-Bande an Position Bq21 (vgl. Abbildung 19). Obwohl es bisher nicht gelang, durch die gleichzeitige Hybridisierung mit mehreren Oligonukleotid-Sonden eine Kolokalisation mit eindeutigen Signalen durchzuführen, zeigen die Signale der verschiedenen Motive an der Chromosomenposition Bq21, daß die Motive an dieser Stelle gehäuft vorliegen. Ähnliche Häufungen von mehr als drei Mikrosatelliten-Motiven treten auch an den Position Aq21.3, Aq31 und Kq21-23 auf.

Die beiden Motive (GATA)4 und (GACA)4 kommen auf zwei Chromosomen an den selben Stellen vor. Allerdings weist (GATA)4 auf Chromosom A zwei Loci auf, während (GACA)4 auf diesem Chromosom nur einen Locus zeigt. Diese Beobachtung korreliert mit den Ergebnissen des DNA-Fingerprinting bei Phaseolus, wonach die beiden Motive in überwiegend gemeinsamen Filterhybridisierungs-Banden detektiert wurden (Hamann et al. 1995). Von 305 Restriktionsfragmenten die bei Hybridisierung mit (GACA)4 Banden aufwiesen, zeigten 296 auch Banden mit (GATA)4. Umgekehrt ließen von 1635 Fragmenten mit (GATA)4-Banden, 296 auch Banden mit (GACA)4 erkennen. Damit zeigt (GATA)4 sowohl bei der FISH als auch beim DNA-Fingerprinting mehr Loci bzw. Banden als (GACA)4, und an (fast) allen Loci bzw. Banden an denen (GACA)4 vorkommt, läßt sich auch das Motiv (GATA)4 nachweisen. Diese Beobachtung stimmt auch mit den Ergebnissen von Sequenzanalysen von klonierten Restriktionsfragementen (3,8-11 kb) von Lycopersicon überein, in denen (GATA)4 und (GACA)4 gemeinsam vorkommen. Außer diesen beiden Elementen enthielten die Fragmente weitere, ähnliche Mikrosatelliten-Motive (sog. "degenerierte GATA"), von denen angenommen wird, daß sie durch Punktmutationen aus dem GATA-Element entstanden sind (Vosman und Arens 1997).

Bemerkenswert ist bei Phaseolus ferner die Lokalisation der beiden Motive (CA)8 und (CAC)5 an den drei NO-Chromosomen A, I und K jeweils im kondensierten Chromatin der NOR (vgl. Abbildung 15c). Da an den selben Stellen auch die Gene der ribosomalen 18S-25S RNAs zu finden sind, müßten die beiden Mikrosatelliten-Motive zwischen den ribosomalen RNA-Genen eingestreut liegen. Ein vergleichbares gemeinsames Vorkommen des Motiv (GACA)4 in den NOR auf Chromosomen von Mensch, Gibbon, Orang-Utan und Schimpanse wurde bereits von Nanda et al. (1991) beschrieben. Bei Arabidopsis thaliana zeigte der Mikrosatellit (GA)38 bzw. das Oligonukleotid (GA)12 an zwei der fünf Chromosomenpaare starke Signale, die vermutlich im Bereich der NORs liegen. Auf den anderen Chromosomen finden sich die Loci von (GA)n nur mit schwächere Signalintensität im paracentromerischen Heterochromatin (Brandes et al. 1997).

Obwohl fast alle der 12 verwendeten Mikrosatelliten-Motive auf den Polytänchromosomen von Phaseolus mehrere Loci aufwiesen, zeigte kein Element auf allen Chromosomen ein Hybridisierungsmuster, das zur Identifizierung geeignet wäre. Damit ist der sog. GAA-Satellit bisher der einzige Fall, wo Mikrosatelliten-Motive erfolgreich zur Karyotypisierung eingesetzt werden konnten (Pedersen et al. 1996).

Weitere Untersuchungen zur Verteilung verschiedener Mikrosatelliten-Motive wurden an pflanzlichen Metaphasechromosomen von Beta vulgaris (Schmidt und Heslop-Harrison 1996) und Cicer arietinum (Gortner et al. 1998) durchgeführt. Motive, die sowohl in einer der beiden genannten als auch in der vorliegenden Arbeit verwendet wurden, sind (AT)8, (AG)8, (CA)8, (GATA)4 und (GACA)4. Vergleicht man ihre chromosomale Verteilung, zeigen sich mehr Gemeinsamkeiten zwischen Beta und Cicer ((TA)9/10, (CA)8, (GATA)4) als zwischen diesen und Phaseolus (nur (GATA)4). Das Motiv (GATA)4 zeigt als einziges Motiv bei allen drei untersuchten Species eine gewisse Übereinstimmung. Es liegt an einigen Chromosomen von Beta (6), Cicer (4) und Phaseolus (2) mit starken Signalen im centromerischen Heterochromatin und zeigt zusätzlich schwache Signale in euchromatischen Regionen (bei Phaseolus aber nur auf einem Paar). Dies könnte ein Hinweis darauf sein, daß es sich bei (GATA)4 um ein, evolutiv gesehen, "altes" Mikrosatelliten-Motiv handelt (Vosman und Arens 1997).

Aussagekräftige Verallgemeinerungen über die chromosomale Verteilung von Mikrosatelliten-Motive auf pflanzlichen Chromosomen lassen sich aufgrund der geringen Zahl von bisher verfügbaren Vergleichsdaten (drei Motive (TA)9/10, (CA)8, (GATA)4 bei drei Arten) noch nicht treffen. Dazu müßten noch weitere der 49 Mikrosatelliten-Motive bestehend aus Mono-, Di-, Tri- und Tetranukleotiden (Depeiges et al. 1995) untersucht werden.

4.4.4 Lokalisation der Minisatelliten

Die beiden klassischen Minisatelliten, die sog. "Jeffrey-Sonde", eine 33bp-Wiederholungseinheit (repeat) aus einem Intron des humanen Myoglobin-Gens (Jeffreys et al. 1985) und das interne repeat des Protein III-Gens des Bakteriophagen M13 (Vassart et al. 1987) enthalten jeweils eine 16 bzw. 15 Nukleotid-lange Core-Consensus-Sequenz. Synthetische Oligonukleotide der Consensus-Sequenzen (hier mit "33con" und "M13con" abgekürzt) wurden als Sonden verwendet, um ihre Verteilung auf den Polytänchromosomen zu untersuchen. Die Signale der 33con-Sonde lagen terminal auf dem tHC auf allen Chromosomen, wohingegen die Loci der M13con-Sonde im cHC aller Humanchromosomen, insbesondere im Bereich der starken DAPI-Banden, beobachtet wurden (vgl. Beispiele in Fehler! Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.b und c).

Mit Hilfe von Kopplungsgruppen-Analysen wurde bei Phaseolus vulgaris die Position des M13-Minisatelliten an den Enden der zwei genetischen Kopplungsgruppen (D3 und D10) ermittelt, und man vermutete daher eine terminale chromosomale Lokalisation (Stockton und Gepts 1994; Sonnante et al. 1994). Die hier festgestellten Loci der M13con-Sonde im cHC der Polytänchromosomen von P. coccineus scheinen dem zu widersprechen. Allerdings bestand die zugrundliegende RFLP-Karte aus 15 Kopplungsgruppen (Nodari et al. 1993). Da es aber nur 11 Chromosomenpaare gibt, bleibt unklar, welche der 15 einer kompletten Kopplungsgruppe entsprechen und welche Fragmente darstellen, die einer anderen Gruppe zugerechnet werden müssen. Sollte sich herausstellen, daß die Gruppen D3 und D10 Fragmente sind, bleibt noch offen, ob die M13-Loci in vollständigen Kopplungsgruppen noch immer an den Enden liegen.

Die Verteilung des 33bp-repeats sowie des M13-Minisatelliten auf Humanchromosomen sind bekannt. Die Signale der 33.15-Sonde sind präferentiell in der Telomerregion angehäuft (Royle et al. 1988), was ebenso auf die Verteilung bei den Polytänchromosomen von P. coccineus zutrifft. Die Signale von M13 sind jedoch über alle Humanchromosomen, ähnlich einem R-Bänderungsmuster, verteilt (Christmann et al. 1991), was mit der Lokalisation im cHC der Phaseolus Polytänchromosomen nicht übereinstimmt.

4.4.5 Arabidopsis Telomer-Sequenz

Die Hybridisierung mit der Telomer-Sequenz von Arabidopsis thaliana (TTTAGGG)n (Richards und Ausubel 1988), die auch bei zahlreichen anderen Pflanzen vorkommt (Fuchs et al. 1995), zeigte ebenso an allen Enden der Polytänchromosomen von Phaseolus Signale. Diese Beobachtung steht in Übereinstimmung mit einer früheren Beobachtung an Phaseolus-Polytänchromosomen, bei der als Sonde die unter Vertebraten verbreitete Telomer-Sequenz (TTAGGG)n (Meyne J. et al. 1989) verwendet wurde (Nagl 1991).


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